Die Genetik des Lipidstoffwechsels als Risikofaktor für kognitive Defizite bei der Parkinson-Krankheit

Die Parkinson-Krankheit gehört zu den Basalganglienerkrankungen und ist nach der Alzheimer-Krankheit die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Von den typischen motorischen Leitsymptomen sind kognitive Defizite, auch Parkinson-Demenz genannt, abzugrenzen. Etwa 75% der Parkinson-Syndrome sind idiopathisch und treten sporadisch auf. Bei dieser großen Mehrheit der Erkrankten gibt es bislang kein identifizierbares Vererbungsmuster. Für eine intakte Hirnfunktion ist der zerebrale Cholesterinmetabolismus von hoher Bedeutung, sodass kodierende Gene des Cholesterinstoffwechsels in die Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer-Krankheit, involviert sind. Ausgehend von der bekannten pathophysiologischen Überschneidung der Alzheimer- und Parkinson-Krankheit, dient diese Arbeit einer systematischen Untersuchung ausgewählter Gene des Lipidstoffwechsels im Zusammenhang mit der Parkinson-Demenz. Das Kollektiv aus 94 Parkinson-Erkrankten entstammte der Datenbank der longitudinalen LANDSCAPE Studie, wobei 2 Gruppen von Parkinson-Patienten mit Demenz und unbeeinträchtigter Kognition gebildet wurden. Im Vorfeld wurde ein Matching zwecks höherer Vergleichbarkeit der Fall- und Kontrollgruppe anhand der Kriterien Geschlecht, ≥ 6 Jahre Erkrankungsdauer und ± 7 Jahre Altersdifferenz durchgeführt. Als Ausgangsmaterial der laborchemischen Versuche lag isolierte Desoxyribonukleinsäure vor, wobei mittels Polymerase-Kettenreaktion bestimmte Gen-Loci zwecks weiterer Aufschlüsselung amplifiziert wurden. Im Sinne eines genetischen Screenings wurden alle kodierenden Abschnitte der Apolipoproteine E, A1 und J sequenziert, wobei es sich um etablierte Risikogene der Alzheimer-Krankheit handelt. Zusätzlich wurden ausgewählte Exone von Adenosine Triphosphate-binding Cassette Transporter A1 (Exon 7, 18, 35) und Very-Low-Density-Lipoprotein Receptor (Exon 15) untersucht, bei denen bereits im Vorfeld kritische Mutationen beschrieben wurden. Im Fokus stand dabei die Identifikation von Einzelnukleotid-Polymorphismen, die möglicherweise mit der Ausprägung einer Demenz bei der Parkinson-Krankheit zusammenhängen. Im Rahmen der Sequenzierung mit Hilfe der Kettenabbruchmethode nach Sanger wurden insgesamt 8 Einzelnukleotid-Polymorphismen identifiziert, darunter 7 missense Mutationen und eine synonyme Variante. Apolipoprotein A1 und Very-Low-Density-Lipoprotein Receptor wiesen keine Mutation auf. Eine statistische Signifikanz konnte für keinen Einzelnukleotid-Polymorphismus gezeigt werden. Dementsprechend konnte kein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein einer Mutation und der Ausbildung einer Parkinson-Demenz in der vorliegenden Stichprobe abgeleitet werden. In der Tendenz waren jedoch 2 Mutationen hervorzuheben: rs7982 (Apolipoprotein J Exon 5) mit einer Odds ratio von 1.575 (95% Konfidenzintervall=0.680~3.646, p=0.288) sowie rs2066714/ rs4149313 (Adenosine Triphosphate-binding Cassette Transporter A1 Exon 18) mit einer Odds Ratio von 1.4 (95% Konfidenzintervall=0.551~3.554, p=0.478). Apolipoprotein J und Adenosine Triphosphate-binding Cassette Transporter A1 stellen somit als mögliche Risikogene der Parkinson-Demenz das Ziel weiterer Analysen dar. Als Limitation der Arbeit war die geringe Fallzahl bei initial zu hoch geschätzter Effektgröße zu betrachten, sodass die fokussierte Untersuchung in Bezug auf oben genannte Mutationen an weiteren Patienten der LANDSCAPE Studie sinnvoll und in Zukunft geplant ist

Die Effekte des α7-nikotinergen Acetylcholin-Agonisten PNU-282987 und des nikotinergen Acetylcholin-Antagonisten Mecamylamin auf Neuroinflammation und Neurodegeneration im akuten MPTP-Mausmodell des Morbus Parkinson

Das idiopathische Parkinson-Syndrom (IPS) zählt zu den häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen. Es ist pathogenetisch durch die Degeneration dopaminerger Neurone und eine begleitende Neuroinflammation in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) gekennzeichnet. Die Ätiologie der Erkrankung ist trotz intensiver Forschung unbekannt. Ein kausaler Therapieansatz konnte bisher nicht gefunden werden. Zunehmend gibt es Evidenz dafür, dass die durch aktivierte Mikroglia ausgelöste Neuroinflammation in der SNpc nicht nur Folge der dopaminergen Degeneration ist, sondern selbst zum Zelluntergang beiträgt. Bei Schädigung dopaminerger Neurone in der SNpc kommt es zur Mikroglia-Aktivierung. Aktivierte Mikroglia sezernieren eine Reihe pro-inflammatorischer und potentiell neurotoxischer Faktoren, darunter die Zytokine IL-1β, IL-6 und TNF-α, die wiederum dopaminerge Neurone schädigen können. Dieser Circulus vitiosus – auch als reaktive Mikrogliose bezeichnet – beschreibt eine sich selbst aufrechterhaltende Neurotoxizität, die zu einer fortschreitenden Neurodegeneration führt. Bei schweren Infektionen hat der Körper die Möglichkeit, das Ausmaß der Inflammation über den inflammatorischen Reflex des autonomen Nervensystems zu regulieren. Dessen efferenter Arm wird als cholinerger anti-inflammatorischer Signalweg bezeichnet. Wichtiger Bestandteil dieses Signalwegs ist der α7-nikotinerge Acetylcholin (α7-nACh)-Rezeptor, der auf Immunzellen wie Mikroglia exprimiert wird. Seine Aktivierung führt u.a. zu einer Hemmung der NFκB-Translokation in den Zellkern, zur Aktivierung des Jak2/STAT3-Signalwegs und in der Folge zu einer verminderten Produktion pro-inflammatorischer Zytokine. In experimentellen Modellen verschiedener entzündlicher Erkrankungen konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung dieses Signalwegs die Inflammation eindämmen und das Überleben verbessern kann. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob die Neuroinflammation in der SNpc über diesen Signalweg beeinflussbar ist und ob dies einen möglichen Therapieansatz des IPS darstellen könnte. Anhand des akuten MPTP-Mausmodells wurden die Effekte des selektiven α7-nACh-Agonisten PNU-282987 und des nACh-Antagonisten Mecamylamin auf Neuroinflammation und dopaminerge Neurodegeneration untersucht. Das MPTP-Mausmodell ist das am häufigsten verwendete Tiermodell der Parkinson-Erkrankung. MPTP ist ein Neurotoxin, das selektiv dopaminerge Neurone in der SNpc zerstört und zum Parkinson-Syndrom führt. Die relativ hohe Dosierung der hier angewandten akuten MPTP-Intoxikation (4x 20mg/kg Körpergewicht intraperitoneal im Abstand von 2 Stunden) führt zudem zu einer ausgeprägten Neuroinflammation. Um das Ausmaß der Neuroinflammation zu beurteilen, wurden die striatalen Konzentrationen der pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6 und TNF-α sowie des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 mittels ELISA bestimmt. Die Anzahl aktivierter Mikroglia in der SNpc wurde immunhistochemisch erfasst. Die Auswirkungen der Behandlung auf die dopaminerge Neurodegeneration wurden anhand der Anzahl immunhistochemisch nachgewiesener dopaminerger Neurone in der SNpc untersucht. Zudem wurden die striatalen Konzentrationen von Dopamin, 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) und Homovanillinsäure ebenso wie der Dopamin-Umsatz bestimmt. Mögliche Auswirkungen auf das motorische Verhalten der Tiere sollten mit Hilfe des Rotarod-Tests erfasst werden. Die Behandlung mit PNU-282987 hat die Neuroinflammation in der SNpc im akuten MPTP-Mausmodell abgeschwächt, indem es die Mikroglia-Aktivierung vermindert und den MPTP-induzierten Konzentrationsanstieg von IL-1β und TNF-α reduziert hat. PNU-282987 konnte darüber hinaus den MPTP-bedingten dopaminergen Zelluntergang in der SNpc sowie den striatalen Dopaminmangel reduzieren. Auch die Konzentration von DOPAC wurde erhöht. Die neuroprotektive Wirkung von PNU-282987 ist wahrscheinlich auf sein anti-inflammatorisches Potential zurückzuführen. Allerdings ist nicht auszuschließen, dass PNU-282987 auch über eine Modulation der Neurotransmitter-Freisetzung gewirkt haben könnte. Immerhin findet sich der α7-nACh-Rezeptor auch auf präsynaptischen Neuronen im Striatum, wo er als ligandengesteuerter Calciumkanal fungiert. Die Gabe des nACh-Antagonisten Mecamylamin führte wider Erwarten ebenfalls zu einer reduzierten Neuroinflammation. Allerdings wirkte Mecamylamin nicht neuroprotektiv, was möglicherweise auf seine Eigenschaften als unselektiver Antagonist an nACh-Rezeptoren zurückzuführen ist. Die Ergebnisse dieser Studie bekräftigen die Annahme, dass ein zentraler cholinerger anti-inflammatorischer Signalweg existiert, und demonstrieren das therapeutische Potential einer Aktivierung des α7-nACh-Rezeptors in der Behandlung des IPS

Bewegungskontrolle der Handmotorik bei Patienten mit Asperger Autismus

Einleitung: Patienten, die an einer Autismus-Spektrum-Störung leiden, weisen häufig motorische Defizite unterschiedlichen Ausmaßes auf. Es ist unklar, welche Pathophysiologie und welche Hirnsysteme für diese Bewegungsstörungen verantwortlich sind. Post-mortem Untersuchungen, strukturelle und funktionelle Bildgebungsstudien sowie behaviorale Studien bei Autisten ergaben Hinweise, dass das Kleinhirn dieser Patienten Veränderungen aufweist, welche einen Beitrag zu den beschriebenen Bewegungsstörungen leisten könnten. Eine prädiktive Bewegungskontrolle basiert vermutlich auf sogenannten internen Modellen, die sowohl dynamische Wirkungen eigener Bewegungen als auch Objekteigenschaften sowie die daraus resultierenden sensorischen Feedbackinformationen vorhersehen und in die prädiktiven motorischen Befehle integrieren. Es bestehen Hinweise, dass Regionen des Kleinhirns hirnanatomisches Korrelat solcher interner Modelle darstellen. In dieser Studie wurden motorische Funktionen von Asperger-Patienten auf prädiktive Kontrollmechanismen und Bewegungskoordination anhand einer Reihe von Experimenten untersucht. Methoden: Es wurden die motorischen Leistungen von 11 Patienten mit Asperger-Autismus im Vergleich zu 11 gesunden Kontrollpersonen getestet. Die Gruppen waren alters-, geschlechts- und intelligenzangepasst, alle Teilnehmer waren rechtshändig. In Versuch 1 wurde die Platzierungsaufgabe des Purdue Pegboard Tests durchgeführt. Dabei mussten kleine Metallstifte in untereinander angeordnete, vorgestanzte Löcher schnellstmöglich in einer vorgegebenen Zeit gesteckt werden. Auf diese Weise konnten wir die Feinmotorik und Hand-Auge-Koordination untersuchen und zugleich erhebliche motorische Defizite ausschließen. In Versuch 2 untersuchten wir die prädiktive Bewegungskontrolle anhand der Kopplung von Griff- und Lastkraft beim Anheben eines Objektes. Die Probanden mussten ein Testobjekt greifen und anheben, welches einen Griffkraft- und einen Bewegungssensor beinhaltete. In einer weiteren Versuchsanordnung ließen die Teilnehmer ein Gewicht in ein Behältnis fallen, welches an das mit der kontralateralen Hand gehaltene Testobjekt angebracht war. Dadurch konnte ein prädiktiver Anstieg der Griffkraft untersucht werden. In Versuch 3 griffen die Teilnehmer einen Würfel zwischen Zeigefinger und Daumen. Eine Greifbewegung besteht aus zwei Komponenten: dem Handtransport und der Griffformation. Es wurden mehrere Parameter berechnet, die das örtliche und zeitliche Zusammenspiel der beiden Komponenten beschreiben. Die Greifbewegungen wurden dreidimensional mit einem Bewegungsanalysesystem aufgezeichnet. Ergebnisse: Im Purdue Pegboard Test zeigten Patienten signifikant geringere Werte als Gesunde, insbesondere mit der linken Hand. Die Defizite entsprachen jedoch nicht einer funktionellen motorischen Störung. In den Hebeversuchen wiesen Patienten eine signifikant schlechtere zeitliche Koordination zwischen Griff- und Lastkraftanstieg auf. Im Versuch zur selbstgenerierten Gewichtspertubation konnten beide Gruppen einen prädiktiven Anstieg der Griffkraft entwickeln. Patienten zeigten jedoch eine signifikant höhere Ausgangsgriffkraft und eine geringere absolute Griffkraftzunahme vor Gewichtseinschlag. In den Greifversuchen wählten Patienten eine wesentlich flachere und geradere Annäherung an das Objekt als gesunde Kontrollen. Patienten wiesen zudem eine signifikant kleinere Fingeröffnung und Fingeröffnungsgeschwindigkeit auf. Die Geschwindigkeit des Handtransports war in der Patientengruppe im Mittel deutlich langsamer als in der Kontrollgruppe. Die zeitliche Kopplung zwischen Handtransport und Griffformation unterschied sich zwischen den Gruppen jedoch kaum. Diskussion: In unseren Versuchen offenbarten wir mehrere signifikante Unterschiede der motorischen Leistungen und des motorischen Verhaltens zwischen Asperger- Patienten und gesunden Kontrollpersonen. Dies lässt eine gestörte prädiktive Bewegungskontrolle und eine zerebelläre Störung bei Asperger-Autismus annehmen. Insbesondere zeigten wir, dass Patienten eine veränderte Kopplung zwischen Griff- und Lastkraft beim Heben eines Objekts aufwiesen. Des Weiteren könnte die veränderte Handbewegungskurve in den Greifversuchen aus einem gestörten temporospatialen Zusammenspiel von proximalen und distalen Muskelgruppen resultieren und eine veränderte zerebelläre Verarbeitung von Vorwärtsmodellen widerspiegeln. Die langsamere Handbewegungsgeschwindigkeit der Patienten in den Greifversuchen korrelierte mit deren Leistungen im Purdue Pegboard Test. Wir nehmen an, dass diese Verlangsamung kompensatorisch ist, um eine gestörte Verarbeitung von internen Modellen und deren Integration in die prädiktive Bewegungskontrolle auszugleichen

Evaluierung des natürlich vorkommenden Autoantikörpers gegen α-Synuclein als potentieller Biomarker für das idiopathische Parkinsonsyndrom

Das idiopathische Parkinsonsyndrom (IPS) gehört mit einer Prävalenz von 100-200/100.000 zu den häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen. Das klinische Erscheinungsbild setzt sich aus Tremor, Rigor, Bradykinese und einer posturalen Haltungsinstabilität zusammen. Das histopathologische Korrelat der Symptome zeigt sich in der neuronalen Degeneration vor allem dopaminerger Neurone der Substantia nigra pars compacta. Zudem finden sich zytoplasmatische Amyloideinschlüsse, sogenannte Lewy-Körperchen, in den überlebenden Zellen. Die Lewy-Körperchen bestehen hauptsächlich aus fibrilliertem α-Synuclein, einem neuronalen Protein der Präsynapse. Der Amyloid-bildenden Eigenschaft des α-Synucleins wird eine zentrale Rolle in der Pathogenese des IPS zugesprochen. Es gibt zunehmend Hinweise, dass α-Synuclein Oligomere, Vorstufen der reifen α-Synuclein Fibrillen, das eigentliche zelltoxische Potential tragen. Kürzlich wurden im Serum von IPS-Patienten und gesunden Kontrollprobanden polyklonale Autoantikörper gegen α-Synuclein nachgewiesen. Sie könnten eine Rolle in der physiologischen Metabolisierung des Proteins spielen und besitzen in-vitro einen neuroprotektiven Effekt. Die Diagnostik des IPS wird durch das heterogene Erscheinungsbild und durch die überlappende Symptomatik mit anderen neurologischen Erkrankungen erschwert. Verlässliche diagnostische Biomarker stehen trotz umfangreicher Forschung für den praktisch-klinischen Einsatz bislang nicht zur Verfügung. Insbesondere vor dem Hintergrund aufkommender neuroprotektiver Medikamente sind Biomarker dringend nötig. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit dem Potential der natürlichen Autoantikörper gegen α-Synuclein als diagnostischer Biomarker für das IPS. Hierzu wurde ein indirekter ELISA etabliert und nach gängigen laborchemischen Kriterien validiert, um die Verteilung des Autoantikörpers im humanen Serum quantitativ zu erfassen. Mittels Affinitätschromatographie wurde aus einem kommerziell erhältlichem Antikörperkonzentrat der natürliche Autoantikörper gegen α-Synuclein extrahiert. Im Western-Blot erfolgte die Prüfung der Bindungsspezifität, bevor er als Standard- und Referenzprobe im ELISA verwendet wurde. Diverse Blockierungsreagenzien wurden bezüglich ihrer Reduktion unspezifischer Hintergrundaktivität von humanem Serum im indirekten ELISA getestet. Der etablierte ELISA zeigte eine spezifische Abnahme in der Verdünnungslinearität mit einer Fehlerrate von unter 20%, eine 91%ige mittlere Spike-Recovery und eine Intra- und Inter-Assay Variation von 3,7 bzw. 8,8%. Patienten mit IPS (n=63), Alzheimer Demenz (AD) (n=43) und gesunden Kontrollprobanden (n=46) wurden für die Studie rekrutiert. Neben dem Alter der Probanden, wurde bei IPS Patienten zusätzlich die Krankheitsdauer und –schwere, nach Hoehn und Yahr und dem motorischen Anteil der UPDRS, erhoben. In allen Fällen wurde die Konzentration des natürlichen Autoantikörpers im Serum bestimmt. In einigen Fällen folgte zusätzlich die Bestimmung des freien α-Synucleins im Serum nach einem publizierten ELISA Protokoll. Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied in der Konzentration des Autoantikörpers zwischen den gesunden Kontrollen, Patienten mit IPS und AD (p=0,005; Kruskal-Wallis-Test). In der post-hoc paarweisen Analyse der Gruppen mittels der Dunn’s-Test ergab sich ein Unterschied zwischen gesunden Kontrollen vs. IPS-Patienten (p<0,05), AD- vs. IPS-Patienten (p<0,05) und kein Unterschied zwischen gesunden Kontrollen vs. AD-Patienten. Eine Korrelation zwischen Alter, der Dauer oder Schwere des IPS, der α-Synucleinmenge und der Konzentration des natürlichen Autoantikörpers konnte nicht nachgewiesen werden. Mittels Receiver Operating Characteristic (ROC) Analyse wurde die diagnostische Sensitivität und Spezifität des Assays evaluiert. Die Fläche unterhalb der ROC Kurve ergab einen Wert von 0,662 (95% Konfidenzintervall: 0,561-0,763; p<0.05) für IPS-Patienten vs. gesunde Kontrollen und einen Wert von 0,650 (95% Konfidenzintervall: 0,545-0,754; p<0.05) für IPS vs. AD-Patienten. Nach Bestimmung des Youden-Index zeigte sich für IPS-Patienten vs. gesunden Kontrollen bzw. IPS- vs. AD-Patienten eine Sensitivität und Spezifität von 32% und 98% bzw. von 30% und 95%. Unter Festlegung einer klinisch relevanten Sensitivität von mindestens 85% wurde eine Spezifität für beide Vergleichsgruppen von 25% erreicht. Hinsichtlich des α-Synucleingehalts im Serum unterschieden sich die Gruppen nicht. In der Arbeit konnte zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass der natürliche Autoantikörper gegen α-Synuclein im Serum bei IPS-Patienten in geringerer Konzentration vorliegt als bei gesunden Kontrollen und AD-Patienten. Der etablierte Assay erreicht als diagnostischer Test eine mäßig ausgeprägte Genauigkeit in der Differenzierung der diagnostischen Gruppen. Weitere differenzierte Untersuchungen sind daher nötig, um die Wertigkeit der natürlichen Autoantikörper gegen α-Synuclein als potentieller Biomarker für das IPS abschließend zu prüfen

Physiologische und diagnostische Relevanz der N-Glykosylierung natürlich vorkommender Autoantikörper gegen das Beta-Amyloid Peptid bei der Alzheimer-Krankheit

Die Alzheimer-Krankheit als häufigste neurodegenerative Erkrankung ist ätiopathologisch un-ter anderem durch die Störung der metabolischen Homöostase des Peptids Beta-Amyloid (Aβ42) gekennzeichnet. Interessanterweise finden sich im immunologischen Repertoire des Menschen natürlich vorkommende Autoantikörper wieder, welche eine Aβ42-Reaktivität auf-weisen (nAbs-Aβ42). Ihre Existenz deutet einen die Aβ42-Proteostase betreffenden, regulatori-schen und somit protektiven Mechanismus an, für den die quantitativen und qualitativen Ei-genschaften der Autoantikörper mutmaßlich von entscheidender Bedeutung sind. Die N-Gly-kosylierung als ein prinzipiell entscheidendes qualitatives Attribut von Immunglobulinen, be-einflusst unter anderem deren funktionelle Eigenschaften und könnte auch für die physiolo-gische und somit protektive Funktion der nAbs-Aβ42 von Relevanz sein. Gleichzeitig könnten potentielle Veränderungen der nAbs-Aβ42 Glykosylierung einen entscheidenden Faktor der Pa-thologie darstellen, wodurch sie als diagnostischer Marker zur Identifikation von Alzheimer-Patienten in Frage kommen könnten. Beide Leitgedanken wurden in der vorliegenden Arbeit verfolgt. Für die nAbs konnte zum ei-nen der protektive Effekt auf die Aβ42-Pathologie nachgewiesen und zum anderen eine Ab-hängigkeit dieser physiologischen Wirkung von einer intakten N-Glykosylierung aufgezeigt werden. Diese Resultate liefern zudem wichtige Erkenntnisse für zukünftige therapeutische Strategien auf Basis Aβ42-spezifischer Antikörper, indem sie das Muster und die Komposition der N-Glykane als entscheidende Kriterien für einen wirkungsvollen und nebenwirkungsarmen Ansatz andeuten. Mithilfe der Glykoengineering-Technologie könnten darüber hinaus auch immunologische Prozesse spezifisch moduliert werden, um pathologischen Änderungen der nAbs-Aβ42 Glykosylierung entgegenzuwirken. Tatsächlich waren solche im Rahmen einer Ko-hortenstudie am Fc-Fragment der Autoantikörper von Alzheimer-Patienten nachzuweisen. Auf deren Basis konnte ein generalisiertes lineares Vorhersagemodell entwickelt werden, wel-ches die Zuordnung der Patienten und Probanden mit einer Sensitivität von 95 % und Spezifi-tät von 100 % ermöglichte. Die nAbs-Aβ42 Fc N-Glykosylierung sollte somit als zukünftiger Bio-marker in Betracht gezogen werden, den es gilt, in einer Validierungskohorte zu verifizieren